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輝瑞Science唱罷,默沙東Nature登場:高通量自動化反應篩選的“軍備競賽”

發布時間: 2018-05-16 09:00:11   試劑信息網

發現先導化合物是藥物研發的重要環節,傳統的化學合成、分離、結構鑒定、活性篩選模式存在諸多不足,例如目標不明確、耗時長、工作量大、成本高、操作繁瑣等等。近年來,隨著自動化技術的發展以及各種分子細胞水平藥物活性評價方法的出現,新藥研發中出現了高通量篩選(high-throughput screening)技術,大大加快了候選化合物的活性篩選速度,同時這一篩選技術的出現也導致待測化學樣品的需求量迅猛增長,并促進高通量合成(high-throughput synthesis)技術的發展。目前,基于分子片段的藥物發現策略是新藥研發的常用方法,通過不同小分子片段連接、合并等方式構建起小分子化合物庫,可以彌補傳統化合物庫篩選所面臨的盲目性大、命中率低以及候選分子結構難以優化等問題。在這種策略中,候選化合物的高通量合成主要依賴于過渡金屬催化小分子片段間的偶聯和酰胺化等有機反應,而高通量活性篩選則廣泛使用基于小分子化合物與靶標蛋白的親和篩選技術。盡管如此,從高通量偶聯合成到高通量活性篩選過程仍需經歷候選化合物產率優化、毫克量級制備、分離純化等漫長步驟,無疑增加了先導藥物發現的時間和成本。


2015年1月,默沙東公司(在美國和加拿大稱“默克”,此外的其他國家和地區稱“默沙東”)的Tim Cernak等研究人員報道了一種自動化高通量化學反應篩選平臺(Science, 2015, 347, 49-53,點擊閱讀相關)。該平臺以微孔板為反應載體,以液相色譜-質譜聯用采集實驗數據,通過自動化操作系統執行整個實驗過程,可以極高效率完成納摩爾量級的C-C、C-O、C-N鍵偶聯反應組合和反應條件的篩選,每天運行1536個反應,并能在線處理實驗數據。3年之后,另一個制藥巨頭輝瑞也推出了自己的自動化高通量反應篩選平臺(Science, 2018,359, 429-434,點擊閱讀相關)。該平臺采用的策略基于近些年火熱的流動化學技術,通過與超高效液相色譜-質譜聯用相結合,可在1天內篩選超過1500多個納摩爾量級的Suzuki-Miyaura偶聯反應。與3年前Tim Cernak等人的技術相比,輝瑞的平臺進步明顯,不但可以在不同溶劑、溫度、壓力等條件下進行反應,還支持數百微摩爾量級的合成以滿足后續生物活性測試的需求。

輝瑞的自動化高通量化學反應篩選平臺照片。圖片來源:Science


輝瑞的文章發表之后僅3個月,默沙東Tim Cernak等人就在Nature 上發表文章,對他們之前報道的自動化高通量反應篩選平臺進行了“大規?!鄙?,增加了一項重要功能——化合物生物活性測試。具體來說,在高通量的納摩爾量級(每個反應消耗少于0.05毫克底物)偶聯反應完成后,使用無需標記的親和選擇-質譜法(Affinity-selection mass spectrometry,ASMS)直接測定反應產物對靶標蛋白的親和性,并進行排序,無需常規方法中極其耗時的純化步驟,也避免了大量無親和活性候選化合物的合成、分離等工作。他們將這種高通量納摩爾量級合成和親和性篩選排序一體化的新技術命名為NanoSAR(Nanoscale synthesis and affinity ranking)。結果表明,該技術可幫助他們快速地從3114個納摩爾量級的偶聯反應中篩選出可抑制靶標蛋白激酶CHK1的產物及其合成條件,大大加快了先導藥物發現的速度,降低了稀缺原料的用量。并且,NanoSAR技術所發現的一些具有潛在活性的化合物,用常規手段完全無法發現。

高通量納摩爾量級的合成與親和性篩選排序一體化技術。圖片來源:Nature


將化學合成與生物活性測試結合起來不算是新想法。不過,當前的大多數策略中,要么生物活性測試不支持高通量的偶聯反應,要么需要在生物活性測試之前對高通量偶聯合成的產物進行純化、預處理等復雜耗時的操作。NanoSAR技術最重要的突破,就是對高通量納摩爾量級偶聯反應完成后的產物混合物進行直接的親和性篩選。如下圖所示,NanoSAR技術第一步(a-c),通過自動化高通量反應平臺對大量底物的組合及反應條件進行篩選,并通過超高效液相色譜-質譜聯用裝置在線檢測每個偶聯反應的產物及產率。第二步(d-g),將所有生成的小分子產物混合并與體外純化的靶標蛋白進行孵育反應,通過體積排阻色譜柱(size exclusion column)分離出小分子產物(作為配體)與靶標蛋白結合的復合物,分離出的復合物再經變性解離以釋放小分子配體,然后對這些小分子配體再進行質譜分析便可獲得其結構信息。需要指出的是,當靶標蛋白含量逐漸降低時,混合物中小分子配體之間將會產生競爭,親和性高的小分子將優先與靶標蛋白結合。通過這種方法,對比不同濃度靶標蛋白與小分子配體作用后的質譜結果的變化,便可以間接辨別不同親和性的小分子配體并對其親和性進行排序。第三步(h, i),根據親和性排序選擇目標分子,按照最佳的反應條件對目標分子進行毫克量級的制備和純化,然后進行常規生物活性測試,如對靶標蛋白的抑制活性Ki或IC50。

NanoSAR技術的流程圖。圖片來源:Nature


為了驗證NanoSAR技術的可行性,研究人員選擇了三種蛋白激酶(ERK2、MK2、CHK1)的多種抑制劑進行實際檢驗。結果表明,NanoSAR技術給出的親和性排序,與常規合成、純化、生物活性測試得到的結果高度一致。以MK2為例,針對18種MK2抑制劑,在自動化高通量反應平臺下,他們以化合物4為模板底物,對18種偶聯底物組合在8種不同反應條件下進行144個納摩爾量級的Suzuki偶聯反應,其中化合物4的消耗僅為5.1毫克。隨后利用ASMS技術從與不同濃度MK2(0.3-4.8 μM)作用后的產物混合物中識別出不同親和性的小分子化合物并排序。根據從納摩爾量級反應中篩選出的最佳反應條件,他們又對18種抑制劑進行了毫克量級的制備,分離純化后進一步測試其生物活性。結果顯示NanoSAR篩選出的親和性高的產物往往具有較強的MK2抑制活性,而親和性低的產物往往MK2抑制活性較差。這表明NanoSAR技術確實能夠通過親和性排序有效區分不同生物活性的小分子化合物。

使用已知的靶標蛋白抑制劑檢驗NanoSAR技術的可行性。圖片來源:Nature


驗證過了之后就是實戰。NanoSAR技術可以高通量快速篩選反應條件、合成砌塊以及產物與靶標蛋白的親和性,使得研究人員可以用它來進行以前無法實現或不可能實現的探索。他們以激酶CHK1為靶標蛋白,嘗試發現此前未知的小分子抑制劑。首先,通過自動化高通量反應平臺對溴代雜環化合物7與17種代表性合成砌塊間在不同反應條件下(催化劑、堿、溶劑)的上千個偶聯反應進行了初步篩選,針對每類砌塊確定出了最佳的四組反應條件。他們接著使用上述四組反應條件,從化合物7與384種不同的合成砌塊(包括48種硫醇、64種醇、32種炔烴、80種硼酸、32種酰胺、32種磺酰胺和96種胺)間的1536個C-N、C-O、C-S、C-C鍵偶聯反應中獲得345種候選產物。隨后,345種粗產物的混合物與不同濃度的靶標蛋白CHK1(0.2-10 μM)作用后,通過ASMS可快速識別這些候選產物與CHK1親和性的高低,并進行排序。結果表明,大多數硫醇、醇、炔烴、磺酰胺類產物對CHK1基本無親和活性,而具有親和活性的分子主要為硼酸、胺、酰胺類產物。根據所得最佳的反應條件及親和性篩選排序結果,研究人員對部分小分子產物進行了毫克量級規模的制備、純化和生物活性測試。結果表明,具有高親和性的產物分子展現出較強的CHK1抑制作用,而無或弱親和性的分子CHK1抑制作用也較差。

NanoSAR技術高通量篩選CHK1抑制劑及其合成條件。圖片來源:Nature


部分化合物的親和性與生物活性(IC50)。圖片來源:Nature


利用NanoSAR技術,實驗人員無需分離產物,快速地進行了3114個偶聯反應,僅僅消耗了123 mg的原料(7),就篩選了多個反應條件組合和384種不同的合成砌塊,得到了345種候選產物及其合成條件(下圖b,黃圈代表反應成功,紫叉代表反應失?。?,并且得到了產物與靶標蛋白的親和性排序。相比之下,按照常規方法篩選384種不同的合成砌塊,僅僅獲得了158種可檢測的產物(下圖a),比NanoSAR技術少187種,而且優化的合成條件也沒有拿到,差距顯而易見。在常規方法無法觸及的187種產物中,NanoSAR技術預測其中21種是潛在的活性化合物并且給出了合成條件。后續的合成、純化和生物活性測試結果也驗證了這一點——這21種化合物中,有一些(例如化合物42–45)抑制CHK1的IC50在nM量級,活性很高(下圖c)。也就是說,常規方法無法發現的潛在藥物小分子,在NanoSAR技術里就不會被埋沒。

NanoSAR技術與常規技術的對比。圖片來源:Nature


——總結——


默沙東公司的這項研究為藥物發現提供了強大的工具,結合自動化高通量納摩爾量級化學反應與親和選擇-質譜法,他們不僅可以用最少的原料、在最短的時間內評估數千個納摩爾量級的反應,篩選反應底物和反應條件,并且無需分離純化就能夠對大量產物混合物進行靶標蛋白親和性篩選和排序,以預測這些產物的生物活性,并且由此指導后續的合成、純化、生物活性測試等等工作。毫無疑問,將高通量反應篩選與親和性篩選整合起來的NanoSAR技術,可幫助藥物化學家避免大量無生物活性化合物的合成和分離純化工作,更全面和更快速地篩選化合物,由此找出最具潛力的目標,提高藥物發現的“命中率”。


同為頂尖的制藥公司,默沙東和輝瑞免不了有些競爭。不過這種藥物發現領域中關于新方法、新設備的“軍備競賽”應該是大家愿意看到的。更多藥物開發出來,就會有更多患者獲益。筆者內心頗有些期待,輝瑞下一次會帶來什么樣的創新呢? 


原文(掃描或長按二維碼,識別后直達原文頁面):

Nanoscale synthesis and affinity ranking

Nature, 2018, 557, 228–232, DOI: 10.1038/s41586-018-0056-8

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